Desarrollo analítico de
derivados del fenol en agua utilizando cromatografía de líquidos
Analytical development of phenol
derivatives in water using liquid chromatography
Alfonso Lemus-Solorio1
1Facultad de Ingeniería Química, Universidad Michoacana de San Nicolás de
Hidalgo.
2Facultad de Ciencias Físico-Matemáticas de la Universidad Michoacana de
San Nicolás de Hidalgo.
Ciudad Universitaria; Avenida Francisco J. Múgica S/N Ciudad Universitaria, Edificio “E”, Planta Baja. Laboratorio de Investigación a Microescala. Morelia, Michoacán, México.
Autor de correspondencia: Alfonso Lemus Solorio, Facultad de Ingeniería Química de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.
E-mail: 1209689x@umich.mx. ORCID: 0000-0003-2736-5600.
Recibido: 16 de Abril del 2021 Aceptado:
10 de Mayo del 2021 Publicado: 28 de Mayo del 2021
Resumen. - Se ha desarrollado un método analítico por cromatografía de líquidos de
alta eficiencia para la determinación de cloro y nitrofenoles al nivel de
trazas (µg/L) en agua, empleando un gradiente de elución de fase reversa y un
detector ultravioleta (UV). Se empleó un método de Extracción en Fase Sólida
(EFS), que implicó el diseño de un sistema bidimensional de pre-columnas
acoplado con la cromatografía de líquidos de alta eficiencia (CLAE) con el fin
de efectuar la preconcentración, purificación y aislamiento de los solutos en
matrices acuosas ambientales. Estos compuestos fenólicos son considerados
contaminantes prioritarios por la Agencia de Protección Ambiental de los
Estados Unidos (USEPA); los compuestos son: 4,6-dinitro-2-metilfenol,
2,4-dimetilfenol, 4-cloro-3-metilfenol, 2,4-diclorofenol, 2,4,6-triclorofenol y
pentaclorofenol. El método desarrollado es simple, rápido, exacto y
preciso. Se obtuvieron recuperaciones
mayores del 90 % para los fenoles 4,6-dinitro-2-metilfenol, 2,4-diclorofenol y
2,4,6-triclorofenol, aproximadamente 80 % para el pentaclorofenol y 52 % para
el 2,4-dimetilfenol. Además, se obtuvo una precisión (CV ˂ 5 %) aceptable para
todos los solutos a estos niveles de concentración.
Palabras clave: Compuestos
fenólicos; Gradiente de elución; Sistema de pre-columnas; Cromatografía de
líquidos de alta eficiencia.
Abstract. - A high-performance liquid chromatographic analytical method has been
developed for the determination of chlorine and nitrophenols at trace level
(µg/L) in water, using a reversed-phase elution gradient and an ultraviolet
(UV) detector. A Solid Phase Extraction (SPE) method was employed, which
involved the design of a two-dimensional pre-column system coupled with
high-performance liquid chromatography (HPLC) in order to preconcentrate,
purify and isolate the solutes in environmental aqueous matrices. These
phenolic compounds are considered priority pollutants by the United States
Environmental Protection Agency (USEPA); the compounds are:
4,6-dinitro-2-methylphenol, 2,4-dimethylphenol, 4-chloro-3-methylphenol,
2,4-dichlorophenol, 2,4,6-trichlorophenol and pentachlorophenol. The developed
method is simple, fast, accurate and precise. Recoveries greater than 90 % were
obtained for the phenols 4,6-dinitro-2-methylphenol, 2,4-dichlorophenol and
2,4,6-trichlorophenol, approximately 80 % for pentachlorophenol and 52 % for
2,4-dimethylphenol. In addition, an acceptable precision (CV ˂ 5 %) was
obtained for all solutes at these concentration levels.
Keywords: Phenolic compounds;
Elution gradient; Pre-column system; High performance liquid chromatography.
1.
Introducción
Los
derivados fenólicos cloro, nitro y alquilo son ampliamente utilizados en
diversos procesos químicos como intermediarios en la fabricación de plásticos,
colorantes, pesticidas y medicamentos.
Así, la presencia de estos compuestos en numerosos efluentes
industriales ha dado origen a la contaminación de aguas superficiales y
potables. Por su alta toxicidad para los
organismos vivos y para el hombre, varios compuestos fenólicos han sido
clasificados como contaminantes prioritarios y deben ser monitoreados
continuamente, en ocasiones a muy bajos niveles de concentración, en matrices
acuosas (USEPA, 1980). Este problema ha derivado en la necesidad de
realizar un estricto control de los productos potencialmente peligrosos en el
agua al desarrollar métodos sensibles y eficientes que permitan monitorear
contaminantes traza en agua.
Como
antecedente importante de este trabajo se encuentran los estudios realizados
por Soper y Smith, quienes ya desde 1926 habían publicado constantes de
velocidad de cloración de diferentes compuestos, incluyendo el fenol y algunos
clorofenoles [1]. En las últimas décadas (2006-2008) et al. [2-3],
realizaron experimentos de cloración del fenol en el intervalo de pH 6-9 y
presentaron los perfiles de concentración en función del tiempo del compuesto
progenitor y los 5 clorofenoles formados a partir de éste. Los compuestos de
interés fueron seguidos durante un periodo de 5 horas, utilizando cromatografía
de líquidos con detección UV para su separación y cuantificación. Sin embargo,
las altas concentraciones de fenol (
Las
técnicas analíticas más utilizadas en la determinación cuantitativa de fenoles
son los métodos cromatográficos. La cromatografía de gases es una técnica
analítica poderosa de alta resolución en la determinación de clorofenoles y los
detectores empleados como el de ionización de flama, el de captura de
electrones y la espectrometría de masas son altamente sensibles. Sin embargo,
debido a la alta polaridad del fenol y algunos clorofenoles, estos tienden a
dar picos anchos y coleados. Este inconveniente se evita realizando una etapa
de derivatización para transformarlos en analitos menos polares mejorando así
sus propiedades cromatográficas. Por su parte, la cromatografía de líquidos de
alta eficiencia (CLAE), es una técnica analítica eficiente, sensible, precisa,
exacta y de gran capacidad en la separación de isómeros de posición, permite
ajustar la selectividad de la separación mediante cambios en la composición de
la fase móvil (pH, naturaleza y contenido de disolventes orgánicos).
2. Metodología
Para aplicar el método en muestras de aguas naturales se requiere
realizar un paso previo de filtración empleando vacío y una membrana de nylon
de 0.45 µm de porosidad, previamente sumergida en metanol para minimizar los
riesgos de contaminación de la muestra.
2.1 Extracción y
concentración de los analitos
Este es el pretratamiento de la muestra que se realiza mediante la
Extracción en Fase Sólida.
Este paso se efectúa en una pre-columna de acero inoxidable (30 x 4.6 mm
D.I.) empacada con un adsorbente polimérico del tipo estireno-divinilbenceno de
10 µm de tamaño de partícula (pre-columna RP en la figura 1). Este adsorbente
es de gran capacidad, pero baja selectividad.
La muestra es acidificada a pH 2
para que los solutos queden retenidos en su forma molecular por el adsorbente
no polar. Una bomba isocrática (P2) permite pasar la muestra a través de la pre-columna,
ésta última se encuentra montada en una válvula de conmutación (válvula A) como
se muestra en la figura 1.
Figura 1. Sistema experimental en línea para
efectuar la preconcentración, limpieza y análisis de fenoles. P1:
sistema HPLC para gradiente binario, P2: bomba isocrática, A y B:
válvulas de conmutación, C: inyector, W: deshechos, UV: detector ultravioleta,
RP: pre-columna polimérica de extracción, AX: pre-columna aniónica de
purificación, RP-HPLC: columna analítica C-18.
El volumen de muestra que se carga en la pre-columna es de 50 mL, con el
cuál ninguno de los analitos se fuga de la pre-columna.
2.2 Limpieza del
extracto
Debido a la baja selectividad del adsorbente polimérico, es necesario
efectuar un paso de limpieza del extracto, para ello se aprovechan las
propiedades ácido-base de los fenoles y la característica de los adsorbentes
poliméricos de retener muy poco a los compuestos ionizados. Los valores de los
pKa en agua de los seis fenoles: 4,6-dinitro-2-metilfenol (pKa 4.35),
2,4-dimetilfenol (pKa 10.58), 4-cloro-3-metilfenol (pKa 9.55), 2,4-diclorofenol
(pKa 7.85), 2,4,6-triclorofenol (pKa 6.42) y pentaclorofenol (pKa 5.26).
La limpieza del extracto se efectúa transfiriendo los fenoles con una
mezcla metanol-sosa, desde la pre-columna de fase reversa hacia una segunda pre-columna
(20 x 2 mm D.I.), empacada con un intercambiador de aniones de 10 µm y colocada
en una segunda válvula de conmutación (pre-columna AX en válvula B de la figura
1). Las condiciones óptimas para la transferencia
son con 25 mL de una mezcla metanol-sosa (pH 11) 40:60 v/v.
2.3 Separación y análisis de la mezcla de fenoles
La separación y determinación cromatográfica de los analitos se realiza
acoplando en línea la pre-columna aniónica con la columna analítica (RP-HPLC)
(150 x 4.6 mm D.I.) empacada con una fase reversa C-18, (Spherisorb Ods-2) de 5
µm de tamaño de partícula. Se utilizó un gradiente de disolventes
acetonitrilo-agua (pH 4.5), con un buffer de acetatos. El flujo usado fue de 1
mL/min. La detección de los analitos se realizó con un detector UV. Se fijó la longitud de onda de detección a
270 nm que es un valor típico para la detección de fenoles (Puig, Barceló,
1996).
3.
Resultados y Discusiones
El análisis de la muestra concentrada y purificada se
realiza acoplando en línea la pre-columna aniónica con una columna analítica de
alta eficiencia. Para lograr una buena separación de la mezcla de los seis
fenoles era necesario determinar la composición adecuada de la fase móvil tal
que permitiera efectuar la elución de los solutos, es decir la transferencia en
línea de los analitos de la pre-columna aniónica hacia la columna analítica y
su posterior separación cromatográfica. Al efectuar diversos ensayos se observó
que con la corrida isocrática no se logra obtener una resolución aceptable de
la mezcla de fenoles hidrofóbicos. Los primeros solutos (nitrofenoles y
monoclorofenoles) eluyen rápidamente mientras que los fenoles multiclorados
tienen tiempos de retención muy largos y dan lugar a picos excesivamente anchos
y difíciles de integrar.
Además, como este método se desarrolló para aplicarlo
en muestras de agua residuales y superficiales, se pretendió que los tiempos de
retención de los primeros solutos eluidos fueran relativamente grandes con el
objeto de que todas las interferencias presentes en la matriz, no eliminadas
durante los procesos de preconcentración y limpieza, y que generalmente eluyen
a tiempos de retención muy cortos, pudieran interferir en el análisis y
detección de los solutos de interés [6].
En efecto, cuando se trabaja con muestras de aguas
naturales, es común observar al principio del cromatograma la elución de un
gran pico de matriz que desciende muy lentamente y dificulta o hace imposible
la cuantificación precisa de los analitos poco retenidos. Por esta razón, se
ensayó la elución en gradiente, siendo la separación cromatográfica más
adecuada la mostrada en la figura 2.
Figura 2. Separación de la mezcla de fenoles con
gradiente de elución usando como fase móvil: Fase A: acetonitrilo-agua (pH
4.5) (15:85) v/v, y la fase B: acetonitrilo-agua (pH 4.5) (70:30). Buffer
de ácido acético- acetato de sodio. El tiempo de separación es de
aproximadamente 40 minutos. Flujo 1 mL/min, detector UV. Sensibilidad 0.05
AUFS. El orden de elución de los analitos es: 1) 4,6-dinitro-2-metilfenol,
2) 2,4-dimetilfenol, 3) 4-cloro-3-metilfenol, 4) 2,4-diclorofenol, 5)
2,4,6-triclorofenol y 6) pentaclorofenol.
El
gradiente usado es el siguiente (tabla 1):
|
Tiempo
(min) |
0 |
35 |
50 |
|
% B |
8 |
60 |
60 |
Tabla 1. Gradiente de concentración
utilizado.
La evaluación estadística de este método desarrollado para la determinación de trazas de cloro y nitrofenoles en agua mediante el empleo de un sistema bidimensional de pre-columnas acopladas en línea con la cromatografía de líquidos permitió determinar su precisión y exactitud, los cuáles se determinaron al analizar 8 réplicas de agua dopada con los fenoles a una concentración de 13.3 µg/L (Tabla 2).
Tabla 2. Precisión y exactitud del método
|
Compuesto |
% de recobro |
% Coeficiente de
variación (CV) |
|
4,6-dinitro-2-metilfenol |
95.2 |
1.8 |
|
2,4-dimetilfenol |
52.6 |
2.5 |
|
4-cloro-3-metilfenol |
94.4 |
2.0 |
|
2,4-diclorofenol |
94.6 |
1.1 |
|
2,4,6-triclorofenol |
100.3 |
2.6 |
|
pentaclorofenol |
82.2 |
2.8 |
Intervalo lineal del método. Este
parámetro debe estudiarse adecuadamente cuando se analizan trazas de analitos.
Representa el intervalo lineal de concentraciones en el cual se cumple la
proporcionalidad entre la concentración de analito y su respuesta. Dentro de
este intervalo lineal se puede determinar el compuesto de interés por interpolación
[7]. El estudio de la linealidad de este método desarrollado se analizaron
muestras de agua grado cromatográfico dopadas con cada uno de los seis fenoles
empleando un intervalo de concentraciones de 1.33 a 100 µg/L. El método es
lineal en el intervalo de concentraciones de ~ 1.3 a ~ 90 µg/L.
Se desarrolló un método simple y eficiente para la
determinación de cloro, nitro y metilfenoles en agua. En esta metodología la
manipulación de la muestra es mínima por lo que se favorece la precisión de las
determinaciones y se reducen los riesgos para el analista. Una ventaja
adicional es que el método puede ser casi completamente automatizado utilizando
válvulas de conmutación activadas mediante señales eléctricas, por lo cual
resulta idóneo para emplearse en análisis de rutina [8].
4. Conclusiones
La determinación cuantitativa de trazas de cloro y nitrofenoles en agua a
niveles de trazas (µg/L) se puede realizar de manera simple, rápida y eficiente
empleando un método en línea de EFS acoplada a la cromatografía de líquidos.
Esta metodología desarrollada permite minimizar los riesgos de pérdida y
contaminación de la muestra. El método es lineal en el intervalo de
concentraciones de ~ 1.3 a ~ 90 µg/L. La precisión de recuperación es aceptable
(CV ˂ 5 %) y la exactitud obtenida para cinco de los fenoles se considera buena
para estos niveles de concentración.
5. Reconocimiento de autoría
Alfonso Lemus-Solorio: Investigación;
Escritura borrador original; Metodología. María Elena Núñez-Gaytán: Investigación;
Metodología; Supervisión; Adquisición de fondos. Ana María Núñez-Gaytán:
Conceptualización; Metodología; Recursos. Martha Angélica Lemus-Solorio: Análisis
formal; Curación de datos; Metodología; Escritura borrador original. Sandra
Núñez-Hernández: Conceptualización; Validación; Análisis formal.
Referencias
[1] F. G. Soper and G. F. Smith, “CCVI. —The
halogenation of phenols,”
J. Chem. Soc., vol. 129, no. 0, pp. 1582–1591, 1926, https://doi.org/10.1039/JR9262901582.
[2] F. Ge, L. Zhu, and H. Chen, “Effects
of pH on the chlorination process of phenols in drinking water,” J. Hazard.
Mater., vol. 133, no. 1, pp. 99–105, 2006, https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2005.09.062.
[3] F. Ge, L. Zhu, and J. Wang,
“Distribution of chlorination products of phenols under various pHs in water disinfection,” Desalination, vol. 225, no. 1,
pp. 156–166, 2008, https://doi.org/10.1016/j.desal.2007.03.016.
[4] USEPA. Ambient Water Quality Criteria
for Chlorinated Phenols, United. States. Environmental Protection Agency, EPA
440/5-80-032. A1-C124, Washington D.C. (1980).
[5] D. Puig and D.
Barceló, “Comparison of different sorbent materials for on-line liquid-solid extraction
followed by liquid chromatographic determination of priority phenolic compounds
in environmental waters,” J. Chromatogr. A, vol. 733,
no. 1, pp. 371–381, 1996, https://doi.org/10.1016/0021-9673(95)01136-6.
[6] A. M.
Núñez-Gaytán, L. E. Vera-Avila, M. G. De Llasera, and R. Covarrubias-Herrera, “Speciation and
transformation pathways of chlorophenols formed from chlorination of phenol at
trace level concentration,” J. Environ. Sci. Heal. Part A, vol. 45, no. 10, pp.
1217–1226, Jul. 2010, https://doi.org/10.1080/10934529.2010.493785
[7] A. M.
Nuñez-Gaytán, L. E. Vera-Ávila, and M. del R.
Covarrubias-Herrera, “On-line methodology for the trace level determination of
the chlorinated phenol family in water samples,” J. Mex. Chem. Soc., vol. 52,
pp. 185–192, 2008, http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1870-249X2008000300003&nrm=iso.
[8] I.
Canals, E. Bosch, and M. Rosés, “Prediction of the separation of phenols by
capillary zone electrophoresis,” Anal. Chim. Acta, vol. 458, no. 2, pp. 355–366, 2002, https://doi.org/10.1016/S0003-2670(02)00079-X.
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